革兰染色的名词解释_实验步骤

　　革兰染色的名词解释：

　　革兰染色法，由丹麦病理学家Christain Gram于1884年创立，是细菌学中很重要的鉴别染色法，因为通过此法染色，可将细菌鉴别为革兰阳性菌(G+)和革兰阴性菌(G-)两大类。

　　革兰染色的实验原理：

　　细菌的不同显色反应是由于细胞壁对乙醇的通透性和抗脱色能力的差异，主要是肽聚糖层厚度和结构决定的。经结晶紫染色的细胞用碘液处理后形成不溶性复合物，乙醇能使它溶解，所以染色的前二步结果是一样的，但在G+细胞中，乙醇还能使厚的肽聚糖层脱水，导致孔隙变小，由于结晶紫和碘的复合物分子太大，不能通过细胞壁，保持着紫色。在Gˉ细胞中，乙醇处理不但破坏了胞壁外膜，还可能损伤肽聚糖层和细胞质膜，于是被乙醇溶解的结晶紫和碘的复合物从细胞中渗漏出来，当再用衬托的染色液复染时，显现红色。红色染料虽然也能进入已染成紫色的G+细胞，但被紫色盖没，红色显示不出来。

　　①革兰氏阳性细菌的细胞壁

　　G+细菌细胞壁具有较厚(20-80nm)而致密的肽聚糖层，多达20层，占细胞壁成分的60%～90%，它同细胞膜的外层紧密相连(图2-9)。有的G+细菌细胞壁中含有磷壁酸(teichoic-acid)，也称胞壁质(murein)，它是甘油和核糖醇的聚合物，磷壁酸通常以糖或氨基酸的酯而存在。由于磷壁酸带负电荷，它在细胞表面能调节阳离子浓度。磷壁酸与细胞生长有关，细胞生长中有自溶素(autolysins)酶类起作用，磷壁酸对自溶素有调节功能，阻止胞壁过度降解和壁溶。

　　如果细胞壁的肽聚糖层被消溶，G+细胞成为原生质体(protoplasts)，细胞壁不复存在，而只存留细胞膜。除链球菌外，大多数G+细菌细胞壁中含极少蛋白质。

　　②革兰氏阴性细菌的细胞壁 Gˉ细菌细胞壁比G+细菌细胞壁薄(15～20nm)而结构较复杂，分外膜(outer membrane)和肽聚糖层(2～3nm)。在细胞壁和细胞质膜之间有一个明显的空间，称为壁膜间隙(periplasmic space)。

　　外膜 Gˉ细菌细胞壁外膜的基本成分是脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)，它同细胞质膜相同之处也是双层类脂，但除磷脂外还含有多糖和蛋白质。

　　LPS的多糖部分包括核心多糖和O-特异多糖。O-特异多糖由重复分支的碳水化合物分子组成，含有已糖(葡萄糖、半乳糖和鼠李糖)和二脱氧已糖。由于糖的种类不同，使各种Gˉ细胞具有不同特性的LPS。核心多糖(core polysaccharide)的主要组分是酮脱氧辛酸(ketodeoxyoctonate, KDO)。

　　外膜中还含有几种蛋白，如脂蛋白、通透蛋白。有些蛋白具有通孔作用(porin)，调控外界分子进入细胞;有的蛋白分子可以作为噬菌体的受体;许多G-细菌对高等生物有致病性是由LPS的成分决定的，它的毒性组分常称为内毒素(endotoxins)。

　　肽聚糖层 Gˉ细菌细胞壁的肽聚糖层很薄，在大肠杆菌和其它细菌中仅有单层。肽聚糖层和外膜的内层之间通过脂蛋白连接起来。

　　壁膜间隙 Gˉ细菌细胞壁的外膜与细胞质膜之间存在明显的壁膜间隙，一层薄的肽聚糖处于其间，肽聚糖层和细胞质膜之间的间隙较宽，肽聚糖层至外膜之间的间隙较窄。大肠杆菌的壁膜间隙宽度为12～15nm，呈胶胨态。其间含有三类蛋白质：水解酶，催化食物的初步降解;结合蛋白，启动物质转运过程;化学受体(chemoreceptors)，在趋化性中起作用的蛋白。

　　革兰染色的实验步骤：

　　1。 涂片：左手持菌液试管，右手持接种环，用接种环从试管培养液中取一环菌，从酒精灯外焰穿过，于载玻片中央涂成薄层(事先在背面做好标记圆圈)即可，或先滴一小滴无菌水于载玻片中央，用接种环从斜面上挑出少许，与载玻片上的水滴混合均匀，涂成一薄层。

　　拔或塞试管塞时，应将试管口通过火焰略加烧灼，最后将接种环在火焰上烧灼灭菌。

　　2。 干燥：涂片后在室温下自然干燥，也可在酒精灯上略加温，使之迅速干燥，但勿靠近火焰。

　　3。 固定：常用高温进行固定。即手持载玻片一端，标本面朝上，在灯的火焰外侧快速来回移动3~4次，共约3~4秒。要求玻片温度不超过60℃，以玻片背面触及手背皮肤不觉过烫为宜，放置待冷后染色。

　　4. 染色：

　　(1)初染： 加草酸铵结晶紫一滴，约一分钟，水洗。

　　(2)媒染： 滴加碘液冲去残水，并覆盖约一分钟，水洗。

　　(3)脱色： 将载玻片上的水甩净，并衬以白背景，用95%酒精滴洗至流出酒精刚刚不出现紫色时为止，约20—30秒，立即用水冲净酒精。

　　(4)复染： 用番红液染1—2分钟，水洗。

　　5. 镜检： 干燥后，置油镜观察。革兰氏阴性菌呈红色，革兰氏阳性菌呈紫色。以分散开的细菌的革兰氏染色反应为准，过于密集的细菌，常常呈假阳性。

　　6. 同法在一载玻片上以大肠杆菌与枯草芽孢杆菌混合制片，作革兰氏染色对比。

　　革兰氏染色的关键在于严格掌握酒精脱色程度，如脱色过度，则阳性菌可被误染为阴性菌;而脱色不够时，阴性菌可被误染为阳性菌。此外，菌龄也影响染色结果，如阳性菌培养时间过长，或已死亡及部分菌自行溶解了，都常呈阴性反应。